近日，由南京大学蒋青教授团队和清华大学杜亚楠教授团队，共同在Bioactive Materials（《生物活性材料》）杂志【IF：14.593】发表了题为“A low dose cell therapy system for treating osteoarthritis: In vivo study and in vitro mechanistic investigations（一种治疗骨关节炎的低剂量细胞疗法：体内模型研究与体外模型机制探讨）”的研究文章。

研究发现：采用由3D规模化培养工艺制备的承载有间充质干细胞（MSC）的微载体（即MSC微组织）作为干细胞治疗的给药平台，可以解决传统游离干细胞给药治疗骨关节炎所面临的系列问题，有望减少治疗应用所需的细胞剂量和注射频率，并通过分泌组学和全转录组分析探究了MSC微组织应用于骨关节炎治疗的潜在作用机理。

【研究背景】

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种非炎症性的退行性疾病，病理表现为关节软骨退行性病变、继发性骨质增生等特征，在我国病发率高达15%以上，且近年逐渐呈现“年轻化”的趋势，呈关节僵硬、肿大、疼痛、关节周围肌萎缩等临床症状，严重影响患者的生活质量。

得益于间充质干细胞（MSC）的自我更新、定向分化、免疫调节等方面的潜力与易获取性，基于MSC的干细胞治疗正作为一种新兴的再生医学疗法广泛应用于骨关节炎的临床前研究和临床研究中，并初见成效；在2021年发表于《中国医学前沿杂志（电子版）》的《骨关节炎临床药物治疗专家共识》一文中，MSC入列为骨关节炎治疗的生物制剂类候选药物。

但在传统的给药方式中，采用关节腔内注射游离MSC仍存在如细胞剂量、细胞流失、细胞存活、与宿主组织的整合等一系列问题，限制了其疗效的稳定性，因此需要开发更有效的细胞制剂形式和递送平台。从2014年起，清华大学医学院杜亚楠教授团队率先于国际上提出“干细胞药剂学”的概念，采用3D多孔微载体复合干细胞进行制剂和给药，在糖尿病及其并发症、骨关节炎、肝纤维化等领域取得了一系列研究进展。

【研究内容】

▲图｜本研究的技术路线设计

1、体外3D培养形成MSC微组织

研究结果表明，应用华龛生物3D FloTrix® 微载体联合搅拌式生物反应器能够在体外培养中实现MSC微组织的形成。在一定培养周期内，微组织中的干细胞保持高活率（绿色荧光标记活细胞，红色荧光标记死细胞），干性相关基因（Sox2、Oct4、Nanog）表达上调、衰老相关基因（P21、P16、P53）表达下调；相较于独立注射的游离MSC，通过微组织形式给药的MSC在小鼠体内可留存长达21天以上，存活效率更高。

2、MSC微组织对体内OA模型的治疗

在本文的体内模型研究中，通过对大鼠实施前交叉韧带 (ACL) 横断手术来构建体内OA模型（图A）。结合Micro-CT（μ-CT）、放射性成像和组织学分析，经对比不同治疗方法，单剂次注射1×10⁵起始细胞数的MSC微组织与4剂次注射1×10⁶游离MSC的治疗效果相当（影像学分析与组织学分析的图片请参看原文）。

【MDCK细胞应用疫苗情况】

MDCK 细胞与病毒亲和性高、增殖速度快且不易发生突变，目前被认为是适合用于甲、乙型流感疫苗生产的细胞系之一。MDCK最初需要贴壁培养，但传统二维平面培养不利于逐级放大，随着微载体的发现和使用，这个问题逐渐得到解决。微载体可实现贴壁细胞悬浮培养，可有效增大一批次细胞培养量和病毒收获量。

3、MSC微组织与软骨细胞的互动机制探究

本研究从患有膝骨关节炎的供者获取软骨组织、分离原代软骨细胞后，通过Transwell建立起体外OA模型，分别采用二维培养的MSC（2D培养组）或三维培养的MSC微组织（3D培养组）与原代软骨细胞进行共培养（图A）。与软骨再生相关的COL2和SOX9在3D培养组的软骨细胞中表达显著上调，并通过Western Blot验证COL2和SOX9在蛋白水平上也高表达（图B），说明MSC微组织相比游离细胞给药或许更能有效促进软骨再生。

本研究在体外模型的基础上进行了大量组学分析。对共培养上清液的分泌组学分析显示，3D培养组中对软骨修复起重要作用的GM-CSF分泌量高，并且IL-6R含量低（图C），说明MSC微组织相比于游离细胞给药可起到抑制炎症、促修复的效果。通过全转录组RNA测序对比不同组别中各种细胞的差异化表达基因（DEG），结合GO富集分析与KEGG pathway分析，发现在3D培养组中：MSC呈现出与早期软骨诱导分化过程相似的基因表达，软骨细胞呈现出更有利于维持关节软骨相关表型的基因表达，并且细胞因子与受体互作的通路更为灵敏、MSC与软骨细胞之间的旁分泌互作更为有效（更多分析细节请参看原文）。该结果进一步阐释了MSC微组织相比于游离细胞给药疗效更显著的潜在原因。

【研究结论】

本研究提出以3D规模化培养工艺制备的微组织作为干细胞递送平台，能够减少MSC治疗所需的细胞剂量和注射频率即达到与传统高剂量给药方式相近的疗效，并通过分泌组学与全转录组分析表明微组织给药更有利于促进MSC与软骨细胞之间的相互交流，通过自分化、抑炎性微环境调控和旁分泌效应促成软骨再生。3D FloTrix® 微载体的应用技术有望加速MSC在骨关节炎中的应用进展。

【研究团队】

● 本项研究由南京大学、清华大学以及北京华龛生物科技有限公司合作完成。

● 南京大学蒋青教授和清华大学医学院杜亚楠教授为本论文通讯作者。

● 蒋青教授课题组王斌博士（现就职于浙江大学附属第一医院）和北京华龛生物科技有限公司总经理刘伟博士为本论文的共同第一作者。

南京大学医学院-蒋青教授

主要从事骨科及运动医学临床和基础研究，是国内运动医学专业唯一的国家杰出青年基金获得者。

任国际关节炎协会（OARSI）任职理事、SICOT中国分会基础研究分会副主任委员、国际软骨损伤修复学会（ICRS）中国分会副主委。

共发表中文核心论文200余篇、SCI论文100余篇（发表在Nature Medicine，Nature Genetic，ACS Nano等杂志）2007有篇论文被评为中国最有影响的百篇国际论文，文章总引用数为825次，单篇最高他引为119次。

蒋青教授团队获得多项国家专利，其中包括三维打印技术专利2项，踝关节屈伸运动器专利1项，膝关节置换专利2项，修复关节软骨损伤专利1项等

清华大学医学院-杜亚楠教授

在“微组织工程”交叉研究方向进行创新探索，实现理论探究和技术转化。

开发的3D微组织技术可作为新一代细胞药物的扩增制备平台和药剂学递送系统，革新体外细胞培养和再生医学；同时可辅助建立仿生生理/病理模型，用于高通量药物筛选和病理机制研究。

共发表高影响力 SCI 论文 100 余篇 (发表在 Nature Materials，Nature Communications, PNAS，Science Advances 等杂志)。

批准授权专利 16 项，相关微组织工程技术专利技术于 2018 年成立北京华龛生物科技有限公司进行转化应用和商品化。

【研究应用材料及设备】

3D TableTrix®微载体（多孔明胶微载体）  3D FloTrix®vivaSPIN生物反应反应器（搅拌式）   3D FloTrix®miniSPIN生物反应器（搅拌式）

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.05.029

参考文献：

《骨关节炎临床药物治疗专家共识》：

http://www.yixueqianyan.cn/CN/abstract/abstract3673.shtml

【华龛生物】

北京华龛生物科技有限公司由清华大学医学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。核心技术源于清华大学的科技成果转化。公司专注于打造原创3D细胞“智造”平台，提供基于3D微载体的细胞规模化定制化扩增工艺整体解决方案。

华龛生物核心产品3D TableTrix®微载片（微载体），是自主创新型、首款可用于细胞药物开发的药用辅料级微载体。已通过中检院等相关权威机构的检验报告，并获得2项国家药监局药用辅料资质（CDE审批登记号：F20210000003、F20210000496）。同时，产品获得美国FDA DMF药用辅料资质（DMF：35481）。 

华龛生物的产品与服务，可广泛应用于基因与细胞治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发。同时，在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）领域也具有广泛应用前景。

公司拥有研发与转化平台5000平米，其中包括CDMO平台1000余平；GMP生产平台4000平米，新建1200L微载体生产线。相关技术已获得100余项专利成果，30余篇国际期刊报道。核心技术项目已获得多项国家级立项支持与应用。