【前言】

背景：

人多能干细胞（hPSC）研究已经在再生医学、疾病建模、药物筛选和发现以及基于干细胞的治疗方面取得了重大进展。

局限：

在相关临床应用中，需要大量hPSC，而稳定的大规模hPSC生产制备仍受到传统二维培养的限制：无法满足hPSC扩增需要的足够表面积，并因此产生了更高的耗材试剂成本和时间成本。

突破：

hPSC可以通过聚集体的形式进行悬浮培养，3D悬浮培养可以支持更高密度的hPSC生长，显著降低培养基使用量，适用于规模化hPSC放大培养的多种应用。

在hPSC悬浮培养过程中，聚集体的控制是非常重要的，特别是在早期聚集体的形成阶段。因此，产生许多大小可控的团聚体，且能形成均匀的混合效果，使细胞能稳定生长极其重要。

hPSC可在华龛生物的3D FloTrix® miniSPIN 生物反应器中均匀成团并稳定生长，细胞4天可增殖3倍以上，多能性相关指标SSEA4与OCT4阳性率可维持在90%以上，是理想的hPSC悬浮培养系统。

【hPSC 培养案例】

1. 培养方法

① 125mL转瓶准备

将125mL玻璃转瓶清洗干净，安装桨叶时尽量调整桨叶位置使其靠近转瓶底部，桨叶位置过高将导致细胞无法形成聚集体。

安装好后进行高压蒸汽灭菌、烘干备用。（若使用一次性转瓶则无需进行此步骤。）

② 细胞复苏

提前将完全培养基恢复至室温，复苏hPSC细胞，以5×105/mL的密度接种于125mL转瓶中，培养基为含ROCK抑制剂的(10μM Y27632)的mTeSR培养基。

将转瓶置于3D FloTrix® miniSPIN反应器上，70rpm避光培养过夜。培养体系30-65 mL。

③ 细胞换液

hPSC细胞悬浮培养需要每天进行半换液。将转瓶在超净工作台上静置5min，从液面靠上方吸取一半培养液到50 mL离心管中，适当吹打转瓶中的培养液防止聚集体融合。

将装有培养液的50 mL离心管离心，吸弃上清，加入等体积不含ROCK抑制剂的mTeSR培养基，将培养液转移到转瓶中。

将转瓶放到反应器上继续培养。注意操作过程中细胞聚集体不可静置超过15min，否则会促使聚集体发生融合。

④ 细胞传代

细胞培养4~5天，镜下观察细胞聚集体粒径在250-350μm范围时可进行传代操作，粒径不可超过400μm，否则会影响细胞干性。

使用Accutase消化液将细胞聚集体消化15min，单细胞进行传代，传代密度为5×105/mL，搅拌速度70rpm。

2. 培养效果

在3D FloTrix® miniSPIN反应器上，细胞成团均一，呈圆润球形。

随培养时间增加，聚集体粒径增加，培养4天粒径为222±37μm，细胞增殖3倍以上，细胞活率维持在90%以上。

同时，hPSC干性Marker SSEA4与OCT4双阳比率维持在95%以上，表明细胞在培养过程中维持良好的分化功能。

【结论】

使用3D FloTrix® miniSPIN反应器可以很好的进行hPSC细胞的悬浮培养，可应用于hPSC细胞的扩增、建库与分化。

结合反应器具备的多点控制功能，可用于hPSC细胞分化过程中的条件摸索，反应器配备的125mL培养瓶可通过高压灭菌重复使用，节省耗材设备成本，是理想的hPSC悬浮培养系统。

【相关样品】

3D FloTrix® miniSPIN 生物反应器

▶ 体型小，节省空间，便于放置于不同规格的培养箱中使用。

▶ 主机与控制器分离，不需频繁开启培养箱箱门即可实时操控主机转速。

▶ S1，外形结构小巧；M2，控制模式多样，满足客户不同的需求。

▶ 培养瓶125mL/250mL/500mL，多种规格可选，可高压灭菌、重复使用。

▶ 超低速搅拌设计的主机，转速0 ~120rpm，精度1rpm；

▶ 速度低精度高的平稳运行，能有效提高细胞生长率的同时，可避免搅拌过程中剪切力对细胞的损伤。

▶ 4.3寸触控屏幕的控制器，界面友好，操作简单；

▶ 可实现恒速/变速双模控制，并且具备编程功能，可满足不同的实验需求。

【关于华龛】

北京华龛生物科技有限公司成立于2018年，由清华大学医学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。核心技术源于清华大学科技成果转化，并已获得多项国家级立项支持与应用。

作为高质量三维细胞制造专家，华龛生物提供基于3D微载体的一站式定制化细胞规模化扩增整体解决方案，打造了原创3D细胞智造平台，实现规模化、自动化、智能化、密闭式的细胞药物及其衍生品生产制备，以此帮助全球客户建立最为先进的细胞药物生产线。在开创【百亿量级】干细胞制备工艺管线后，加速向【千亿量级】进发，致力于以3D细胞规模化智造技术赋能细胞与基因治疗产业，惠及更多患者。

目前，华龛生物的产品与服务，已广泛应用于基因与细胞治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发。同时，在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）领域也具有广泛应用前景。

华龛生物拥有5000平米的研发与转化平台，其中包括1000余平的以3D细胞智造及微组织再生医学治疗产品为核心的CDMO服务平台；以及4000平米的GMP生产平台，并新建了1200L微载体生产线。此外还在上海设有2000余平的国际合作与技术应用中心，以技术创新持续融入全球生物产业新业态。