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针对行业挑战，华龛生物开发了相应3D FloTrix® 细胞大规模培养工艺——3D TableTrix® G系列三维多孔可降解微载体，结合生物反应器，实现贴壁细胞的悬浮式培养，随后可通过逐级放大的方式即可实现细胞大规模、高质量扩增。

本文带来G系列微载体，用于293T细胞大规模培养和产毒的工艺分享，通过完整工艺和真实数据，对G系列微载体的应用效果进行详尽说明。

【293T细胞 培养案例】

细胞：293T

微载体：G02（预灭菌）2g/L

培养基：接种DMEM+10%FBS

换液：DMEM+5%FBS

放大比例：1：6

细胞育种：1×10⁸个细胞接种10层工厂，培养72h后用于反应器接种。

第一级细胞接种：

将微载体和培养基提前泵入反应器中进行无菌验证。以2g/L载体密度，4.0×10⁵cells/mL进行接种，间速8-16h后调节为恒速45rpm。

每天进行取样计数，并检测葡萄糖含量，低于1.5g/L时使用换液培养基换液80%，当细胞密度达到3.0×10⁶cells/mL 以上时进行细胞传代。

沉降微载体，PBS清洗2次，用细胞消化酶消化约10-15min，细胞从微载体脱落，使用完全培养基终止消化。

第二级细胞接种：

提前准备微载体（目标体积×2g/L）在反应器中提前用培养基浸泡，进行无菌验证。

将上一级的游离细胞和微载体泵入已准备好不锈钢反应器中，间速8-16h后调节为恒速45rpm。

每天进行取样计数，并检测葡萄糖含量，低于1g/L时使用换液培养基换液80%，选择合适细胞密度进行质粒转染和病毒包被。

细胞放大培养效果：

293T细胞可实现逐级放大，且细胞增殖稳定，最高可实现6.58×106/mL（图1），转罐回收率96%。

图1：293T大规模扩增细胞增殖曲线

细胞转染包装病毒测试：

使用3D TableTrix® 微载体培养293T细胞，转染慢病毒质粒, 培养72h后检测病毒滴度，并与二维平面生产工艺 (2D) 病毒滴度进行对比，结果显示：使用三维微载体包装慢病毒原液滴度与二维平面生产工艺无显著差异（图2），传统二维工艺参数，可轻松转为三维微载体培养工艺，实现大规模病毒收获。

3D TableTrix® 微载体三维培养293T细胞的总产毒量明显高于二维培养（图3），且收获病毒原液宿主DNA (HCD)和蛋白(HCP)残留显著低于二维培养（图4），微载体加反应器培养可实现单批次大批量病毒液收获，且人工成本大幅降低（表1）。

图2. 2D培养和3D培养转染效率和病毒滴度无差异，工艺可转移

图3：293T细胞转染包装慢病毒

图4：3D收获病毒原液宿主DNA (HCD)和蛋白(HCP)残留显著低于2D

表1. 单批次产量高，有效节省人力和空间

工艺应用验证结果：

基于3D TableTrix® G系列微载体的293T细胞大规模培养工艺，在微载体密度2g/L，细胞接种密度30万/mL条件下，5天细胞即可增殖10倍，通过罐内消化的方式传代，细胞回收率均在90%以上。

通过此工艺培养293T细胞，慢病毒原液产量高于二维培养的细胞。本工艺微载体使用操作简单，同时可降解微载体收获细胞，满足基因治疗药物生产需求。

【总结】

相对于现有的的培养方式，3D TableTrix® 微载体G系列在293T细胞的培养中表现出诸多独特优势：

▶ 比表面积大：使用相对低密度的G系列微载体即可实现细胞的大规模扩增；

▶ 可温和降解：实现细胞无损收获，工艺简单，易于放大；

▶ 3D仿生的弹性多孔结构：细胞贴壁更牢，减少搅拌式反应器带来的剪切力，有效保护宿主细胞，降低宿主细胞残留。

使用3D TableTrix® G系列微载体，配合3D FloTrix®自动化生物反应器，短时间即可内收获期望的细胞量，在满足基因治疗产业对细胞数量和质量需求的同时，大大降低人工、时间和仪器耗材等成本，为基因治疗药物研发和生产企业提供了更优选择，带来了全新动力！

【3D TableTrix® G系列微载体】

华龛生物核心产品——3D TableTrix® 微载体，相关技术源于清华大学的科技成果转化，可作为干细胞生长的微环境（Microniche），实现干细胞体外高质量扩增。

• 已获得中检院及三方权威机构的有关检验报告，

报告编号：SH202311161；检字<2023>012302052 号；

• 2项中国CDE药用辅料资质，

备案号：F20200000496、F20210000003；

• 3项美国FDA DMF Ⅱ型 & Ⅳ型、MF Ⅱ型资质，

备案号：037798 & 035481、29721。

通过定制化微载体，满足不同细胞培养需求

华龛生物全系3D微载体

【关于华龛生物】

北京华龛生物科技有限公司成立于2018年，由清华大学医学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。核心技术源于清华大学科技成果转化，并已获得多项国家级立项支持与应用。

作为高质量三维细胞制造专家，华龛生物提供基于3D微载体的一站式定制化细胞规模化扩增整体解决方案，打造了原创3D细胞智造平台，实现规模化、自动化、智能化、密闭式的细胞药物及其衍生品生产制备，以此帮助全球客户建立最为先进的细胞药物生产线。在开创【百亿量级】干细胞制备工艺管线后，加速向【千亿量级】进发，致力于以3D细胞规模化智造技术赋能细胞与基因治疗产业，惠及更多患者。

目前，华龛生物的产品与服务，已广泛应用于基因与细胞治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发。同时，在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）领域也具有广泛应用前景。

华龛生物拥有5000平米的研发与转化平台，其中包括1000余平的以3D细胞智造及微组织再生医学治疗产品为核心的CDMO服务平台；以及4000平米的GMP生产平台，并新建了1200L微载体生产线。此外还在上海设有2000余平的国际合作与技术应用中心，以技术创新持续融入全球生物产业新业态。