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生物制品质控之内毒素检测概述

生物制品质控之内毒素检测概述

  • 分类:公司新闻
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  • 来源:
  • 发布时间:2022-04-27
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【概要描述】去除内毒素对生物制品而言尤为重要,实验证明华龛生物3D TableTrix微载体,从各层面均能满足相关安全性要求和质量标准。

生物制品质控之内毒素检测概述

【概要描述】去除内毒素对生物制品而言尤为重要,实验证明华龛生物3D TableTrix微载体,从各层面均能满足相关安全性要求和质量标准。

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内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖(LPS),脂多糖包括类脂A、核心多糖、O抗原三个组成部分,其中类脂A为一种糖磷脂,是内毒素的毒性部分,与其致病性有关,不同革兰氏阴性菌的类脂A结构基本相似,在它们所引起的感染中,内毒素导致的毒性效应大致类同。O抗原是内毒素引起免疫反应的易变部分。核心多糖主要起连接作用,有时也有抗原性。

图片来源于网络

【内毒素检测的重要性】

内毒素可以通过细菌死亡后的裂解大量释放,还可以通过活菌胞壁发泡的形式释放。在环境中无处不在,其体积小、化学稳定性高、具有较高的热稳定,所以一般的过滤、加热和化学方法不易去除或灭活,可以通过超滤法、干热法、化学降解法去除。

在细胞培养中内毒素摄入不易被察觉,污染源通常来自细胞用微载体、血清、培养液、洗液等。内毒素毒性作用较弱,但人体对内毒素极为敏感。

其影响性主要包括:

1、改变细胞外形,如造成肝细胞外形改变并引发其吸收六碳糖的能力降低。

2、活化细胞,产生讯息传递物质,并影响其下游生物途径反应。如内毒素会活化巨噬细胞使其分泌肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、干扰素(Interferon,IFN),及白细胞介素1(IL-1)等细胞因子,这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢,促使体温升高发热。

3、抑制酵素活性,如血管收缩素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme)。

4、促进或抑制细胞分裂,其效果差异可能与内毒素来源于浓度有关。

5、抑制人工受精 (In Vitro Fertilization) 的卵子受精率。

6、其他方面:如影响细胞附着力、降低肝细胞对胰岛素(Insulin)结合力、降低细胞钾离子流失等。

【内毒素检测方法】

我国《药典》收录的内毒素检测方法为鲎试剂试验法(鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等),鲎试剂试验法包括2种方法即凝胶法和光度测定法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶限度试验结果为准。

1、凝胶法

凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法,其优点是操作简便。

内毒素可与鲎试剂接触激活C因子产生一系列级联反应,也可以由(1,3)-β-D-葡聚糖激活G-因子产生级联反应,都会使鲎试剂变成凝胶状态,因此在使用该方法检测内毒素时需要排除含有(1,3)-β-D-葡聚糖的样品干扰。

图片来源于网络

 

2、光度测定法:浊毒法和显色基质法

①浊度法包括动态浊度法和终点浊度法:是通过鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来测定内毒素含量的方法。

动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。

终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。

②显色基质法包括动态显色法和终点显色法:是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中,产生的凝固酶使特定底物游离出生色团的多少,来检测内毒素含量的鲎试验法,根据产物色度计算内毒素水平,又被称为比色法。

动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间, 或检测色度增长速度的方法。

终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。

供试品能否采用光度法进行检测,须通过干扰试验确定。光度测定法可通过回收率判断出干扰的趋势,尤其对于研究性质的样品(如新产品)更具有优势。

由于光度法的检测范围比凝胶法宽,使得有干扰的样品可以有更大的稀释倍数,对于部分使用凝胶法无法排除干扰的样品,可以尝试使用光度法建立细菌内毒素检测方法。

 

内毒素检测目前面临的问题

鲎试剂检测法是目前最常用的检测方法,它准确、灵敏、简单、快速。目前我国每年对鲎试剂的需求量在1000万支左右,近年来由于浅海附近的生态破坏和人类的捕食扼杀,导致鲎的数量急剧下降,2021年2月5日,国家林业和草原局、农业农村部发布公告,将鲎试剂所用原料“鲎”(中国鲎及圆尾鲎)列为国家二级保护动物。这就意味着内毒素检测试剂原料将受到严格管控。

图片来源于网络

【内毒素检测新方法】

2020 版中国药典《9251 细菌内毒素检查法应用指导原则》提出,减少鲎试剂的使用量可使用人工合成的重组 C 因子法、微量凝胶法等进行内毒素检查。重组C因子是一种化学合成的试剂,性状更稳定,均一性相对也更好。依据反应混合物中的内毒素浓度和其孵育终止时的荧光值之间存在的量化关系来测定细菌内毒素的含量。微量凝胶法与凝胶法操作方法大致相同,不同点是微量凝胶法的鲎试剂用量仅为原方法的十分之一,很大程度的减少了鲎试剂的用量。

 

华龛生物3D TableTrix®微载片细胞培养内毒素检测

内毒素的去除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的,对于细胞治疗产品的质量控制而言更是尤为重要。

采用微载体进行细胞规模化制备,最终收获细胞产品中的内毒素水平是否符合临床应用安全性标准,也是细胞规模化制备过程中质量控制所需要考虑的问题。

华龛生物核心产品3D TableTrix® 微载片为低内毒素设计,该产品已经获得了国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)药用辅料资质备案(F20210000003与F20210000496),同时也完成了美国FDA/DMF药用辅料资质备案(DMF:35481)。

我们采用3D TableTrix® 微载片结合华龛生物125mL、500mL和5L系列生物反应器进行细胞悬浮培养,分多批次检测了动态培养后的细胞上清和细胞悬液(细胞浓度1×106)中内毒素含量。结果表明,经3D TableTrix® 微载片大规模培养后的细胞悬液和细胞培养上清中的内毒素含量均小于0.25EU/mL

图片:前排阳性组,后排阴性组

实验结果实验中阳性对照组均已形成凝胶,阴性组未形成凝胶,代表本次实验成立,如上图。

 

供试品检测中供试品阳性形成凝胶,供试品阴性未形成凝胶并在倒转180°后滑脱,且数据显示本次实验所检测的供试品内毒素含量小于0.25EU/mL,证明采3D TableTrix® 微载片的细胞规模化扩增工艺,不会给细胞终产品带来内毒素的干扰

华龛3D TableTrix® 微载片从标准的建立、原材料的选择和残留检验方法,均能满足监管层面对于细胞大规模扩增CMC中生产用原材料安全性的要求,满足细胞治疗终产品临床应用的质量标准。

 



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