【科研背景】

干细胞是指一类具有高度自我更新与分化潜能的细胞群体，在特定诱导条件下，可分化成为各类功能细胞群，形成相应的组织或器官。干细胞可颠覆常规治疗手段，在治疗多种重大疾病方面有着极大潜能。利用干细胞移植，已经能够治疗多种常规医疗手段无法解决的重大疾病。截止到2022年4月，我国已有26款干细胞产品通过新药注册申报获批进入临床试验，这些产品中应用最多的就是不同组织来源的间充质干细胞。

【培养方式】

目前干细胞的培养模式有二维(传统)培养与三维培养两种。

在间充质干细胞（hMSCs）的临床转化应用过程中，干细胞的培养、传代、扩增工艺是细胞治疗产品CMC(chemistry, manufacturing, controls)的重要一环。干细胞的培养模式有二维(传统)培养与三维培养两种，在上一篇文章《干细胞二维培养和三维培养的特点概述》中已经对其各自的工艺特点进行了介绍。

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目前通过IND进入临床试验阶段的干细胞治疗产品生产工艺，基本采用传统培养瓶二维培养工艺，少量采用多层细胞工厂，即将hMSCs直接接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中进行贴壁培养，以达到细胞培养扩增的目的。但这些方法存在细胞可利用生长面积小、细胞培养容器占地面积过大、细胞收获时质量不均一等缺点。

图为：细胞工厂

图片来源：网络

目前已开发出一些能够显著提高干细胞扩增效率的三维扩增培养新方法，如中空纤维培养体系、基于微载体的悬浮培养技术、多孔生物材料培养技术等，其中微载体悬浮培养技术，因其便于进行大规模培养和收集细胞而广受青睐。然而目前市场上销售的商业化微载体，绝大多数是以收获细胞表达产物为目标，不能满足细胞治疗企业以收获质量稳定、符合临床应用需求的细胞的目的。现有细胞治疗企业不仅要要选择合适的微载体，满足干细胞产业化对干细胞的数量要求，同时也要保障干细胞的关键质量属性，因此不能简单的套用传统微载体应用领域的细胞扩增工艺。华龛生物基于其可降解微载体开发的自动化干细胞3D扩增培养体系，可满足hMSCs的规模化扩增及封闭式收获要求。

图为：通过3D TableTrix®微载体（多孔微载体）进行细胞培养

【华龛3D培养模式】

华龛生物3D培养扩增MSC工艺流程：

通过传统2D工艺对原代收获细胞扩增至种子库，根据细胞特性优化细胞接种量、搅拌转速、溶氧等影响因素，采用不同的3D扩增体系：500mL、5L、10L-15L，实现细胞扩增的逐级放大。

细胞在微载体上达到预期数量时，因微载体的可降解特性，结合特异性微载体裂解液对其进行原瓶裂解，实现细胞温和收获。单批次可收获的细胞数约为T175细胞培养瓶的100倍，同时保证细胞质量满足细胞治疗企业质量标准并保证其均一性。

【案例分享】

• 接种细胞             UCMSCs

• 微载体              3D TableTrix®微载片

• 培养容器             vivaSPIN VS05

• 培养体系             4.5L

1.1 细胞增殖与代谢  

图为：细胞增殖曲线与代谢曲线

1.2 鉴别

   1.21 细胞形态

      图为：3D培养状态                                               图为：3D收获细胞二维贴附状态

    1.22 细胞表面物标记

   1.23 STR图谱

图为：3D收获细胞STR分型图谱

1.3 微生物检测

1.4 成瘤性监测

   1.41 软琼脂克隆形成

   图为：阳性                                                                   图为：3D收获细胞

   1.41 端粒酶活性检测

（蓝色为TERT曲线，淡绿色为内参GAPDH曲线）

图为：阳性性细胞293T的扩增曲线

图为：阴性细胞MRC-5 的扩增曲线

图为：3D收获细胞的扩增曲线

1.5 三系分化

图为：成脂

图为：成骨

图为：成软骨

【结论】 

全自动、封闭式的细胞处理系统是CGT领域未来的工艺发展方向

华龛生物规模化、自动化的细胞制造体系具有以下优势：

1. 封闭的自动化系统保证细胞无菌制造；

2. 易于扩大生产规模，便于质量控制；

3. 显著降低生产成本。

在此基础上，华龛提供基于3D 微载体的规模化、定制化细胞扩增工艺整体解决方案，满足细胞治疗终产品质量和监管要求，助力细胞治疗产品的商业化生产。