【前情提要】

细胞培养一直是细胞生物学中基础且核心的部分，无论是进行细胞性状的研究还是进行细胞药物的开发，都需要以细胞体外扩增技术——即细胞培养技术为基础。而将原有的二维细胞培养向三维细胞培养转化，正是大势所趋。

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对刚接触细胞三维培养的实验人员来说，如何快速得到一套最优三维培养工艺尤为重要。本文将针对3D FloTrix®细胞三维培养工艺验证阶段涉及到的工艺及关键点进行阐述。

【准备阶段】

1.转瓶（spinner flask）:

① 转瓶内表面为非贴附处理表面，使用前需调整好桨叶位置，并对转瓶进行清洗、高温高压灭菌、烘箱烘干后再使用。

图为：3D FloTrix® miniSPIN 转瓶

② 考虑用户的不同使用习惯和需求，华龛生物还有一次性生物反应器转瓶产品以供选择。一次性转瓶即开即用，无需清洗、高温高压灭菌等操作。

图为：一次性转瓶

从左至右依次为125mL、250mL、500mL

  Tips

   ① 桨叶具瓶底0.5cm为最佳距离：

桨叶位置过高导致瓶内液体不均匀，桨叶位置过低会发生桨叶与瓶底摩擦，不利于细胞生长。

图为：桨叶距瓶底部最佳位置

  ②转瓶规格选择：以间充质干细胞为例

图为：不同规格转瓶使用的微载体用量及收获的细胞数

2.种子细胞:

三维培养过程中，种子细胞的质量对培养能否成功起着至关重要的作用。

因此三维接种需对种子细胞进行质检，包括细胞的倍增时间，细胞的活率，以及细胞表面标志物等是否合格。

图为：以间充质干细胞为例

质检项目与标准

 Tips

 ① 如培养细胞类型为干细胞，建议细胞代次在P2-P5之间。

 ② 二维培养的细胞群体倍增时间PDT在19-20h范围之间。

 ③ 二维消化细胞时间不宜过长，方可保持较高的细胞活性。

【二：培养阶段】 

1.细胞3D接种：

将微载片（即开即用）加入无菌转瓶中，加入一定量的培养基，将微载片均匀分散在培养基中，加入细胞，补足培养基。将转瓶置于搅拌主机上，设置转速，进行培养。

Tips

 接种时采用间速培养，可增加细胞贴附率。

（细胞贴附率=接种后24小时细胞数 / 接种时细胞数×100%）

2.细胞培养：培养过程中监测细胞生长状态主要有三个方法。

① 计数：取样后，加入裂解液裂解微载体，进行细胞计数，观察细胞增殖情况；

② 荧光染色：采用活死荧光染色液染色微组织（细胞结合在为载体上），荧光显微镜下可直观观察细胞在微载体上的生长状态，随着三维细胞培养的时间增长，微载体球上的细胞逐渐增多，如下图。

      培养时间24h放大倍数40x           培养时间48h放大倍数40x            培养时间96h放大倍数100x

③ 葡萄糖含量：细胞培养过程中会消耗培养基中的葡萄糖，葡萄糖的消耗会间接反应细胞增殖状态。

图为：细胞浓度与葡萄糖含量的关系举例 

 Tips

 裂解微载体的时间30min±10min为宜。

【三：收获阶段】 

细胞三维培养4-5天，将微载体用温和裂解液裂解后收获细胞。

1.多次实验数据统计，采用3D TableTrix® 结合3D FloTrix® 动态培养工艺，脐带来源的间充质干细胞（UCMSC）的扩增倍率可达10-16倍。

图为：人源脐带MSC细胞扩增曲线图 

2.将UCMSC细胞进行3D连续传代培养，从P4代细胞连续传代6代，细胞96小时仍可保持12-14倍的扩增倍率。

图为：人源脐带MSC连续传代图

【四：质检阶段】 

培养后的细胞，想要进行后期应用，一定要经过严格的细胞质量检验。

1.以间充质干细胞为例：对经过三维培养后的细胞进行质检，四大细胞质检项目均合格。

图为：MSC质量检测四大项目类别

【华龛3D培养工艺】 

随着华龛3D FloTrix® 培养工艺被更多人知晓，越来越多的科研工作者都开始尝试通过3D FloTrix® 工艺进行细胞培养。

目前采用3D FloTrix® 培养工艺培养的细胞类型已有很多种。也期待3D FloTrix® 培养工艺应用于更多种类的细胞培养.....

图为：3D FloTrix® 培养工艺已培养的细胞类型

【华龛技术服务部】 

秘籍虽好，但精力有限？不必担心~

华龛技术服务部提供专业化、精细化、定制化的3D细胞培养服务，为您省去诸多烦恼，把有限的精力投入到无限的研究开发中去......

您在3D细胞培养的过程中有任何问题，或者想要快速优化出一套合适的三维培养工艺，都可以联系我们。

【服务项目】 

3D细胞培养方向：

✦ 提供定制化3D实验方案

✦ 定制化3D细胞培养

✦ 3D细胞培养工艺优化

3D细胞衍生物收集方向：

✦ 3D细胞上清生产服务：

  大批量生产干细胞、工程化细胞培养上清；

✦ 外泌体纯化服务：

  细胞上清中的外泌体纯化；

✦ 质量检测服务：

  细胞上清中无菌、内毒素、支原体、蛋白浓度、细胞分泌因子等检测；

  外泌体的粒子浓度、粒径大小、透射电镜及免疫印迹等鉴定。 

留下您的问题和需求技术人员将会与您详尽沟通