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高质量三维外泌体规模化生产整体解决方案

高质量三维外泌体规模化生产整体解决方案

  • 分类:公司新闻
  • 作者:华龛生物
  • 来源:华龛生物
  • 发布时间:2022-07-05
  • 访问量:628

【概要描述】外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种,是大小在30-150nm的盘状囊泡,由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies, MVB)与细胞膜融合后,以外泌体的形式释放到细胞外,广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中

高质量三维外泌体规模化生产整体解决方案

【概要描述】外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种,是大小在30-150nm的盘状囊泡,由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies, MVB)与细胞膜融合后,以外泌体的形式释放到细胞外,广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中

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  • 发布时间:2022-07-05
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【简介

外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一种,是大小在30-150nm的盘状囊泡,由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies, MVB)与细胞膜融合后,以外泌体的形式释放到细胞外,广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中[1]。

图1 | 细胞外囊泡分类

 

外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质等,广泛参与细胞间物质运输与信息传递,调控生理和病理过程[2]。首先,由于外泌体体积小,纳米级粒子能穿透一般毛细血管的细胞间隙,因此能很好地被利用。其次,外泌体外膜呈现较少的抗原,免疫系统难识别,无免疫排斥反应,因此,外泌体的临床研究应用越来越广泛。

目前,全球已开展258项与外泌体治疗与诊断相关的临床试验,适应症包括:GvHD,黄斑裂孔,重症新冠肺炎,糖尿病等。此外,外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送[3]。

图2 | 外泌体临床实验全球立项分布

图片来源:https://ClinicalTrials.gov

 

【外泌体商业化关键点】 

近年来,为了将外泌体治疗成功推向市场,实现其商业化,有两个关键因素。

1、外泌体“质量”

外泌体的质量关乎于在临床试验中的疗效,那么,分泌外泌体的细胞的质量就尤为重要,3D细胞培养模拟体内生长环境,为细胞提供更适宜生长的三维环境,在细胞的3D培养过程中可随时观察细胞的生长状态,确保细胞保持较高的活性下收集其分泌的外泌体。 

2、外泌体“数量”

实现规模化生产外泌体,还极度依赖于其稳定的、经济的、高效的生产制造工艺,实现规模化生产外泌体。相比于传统2D培养+超速离心的方式,要收获可用于临床研究应用的外泌体可能需要花费数周时间,而既要保证外泌体质量,又希望今天之内就可实现自动化大规模收集细胞上清中的外泌体。华龛生物可提供一整套外泌体生产及纯化的解决方案。

 

3D FloTrix® 外泌体生产纯化整体解决方案】 

图3 | 外泌体生产纯化流程图

阶段一:3D细胞规模化培养

细胞脐带间充质干细胞(UCMSC)

微载体3D TableTrix® 干细胞微载片 W系列 S型 (W02)

培养基3D FloTrix® 三维细胞培养基(RMZ010-DW)

培养容器3D FloTrix® vivaSPIN VS系列生物反应器(FTVS10)

3D细胞培养周期5days

培养结果:一次性收集10L细胞培养上清

细胞生长情况:

               表1                          图四|细胞增殖曲线

 

阶段二:外泌体浓缩收获阶段

细胞培养上清:10L 3D细胞培养上清

纯化设备:3D FloTrix® vivaEXO外泌体收获系统

纯化原理:澄清过滤+浓缩过滤多级过滤系统,收获、富集细胞培养上清中的外泌体。

使用方法:一次性管路耗材包,配套vivaEXO外泌体收获系统使用,将vivaSPIN生物反应器中的出液管路与vivaEXO外泌体收获系统的进液管路相连,即可实现“培养-收获”全封闭式无缝连接。

收集时长:10L细胞培养上清浓缩富集20倍,仅需1-3小时(据培养液的粘稠度而定)

纯化结果:收集500mL高浓度无菌外泌体溶液

 

阶段三:外泌体鉴定

① 纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)检测外泌体粒子浓度及粒径范围:

经过NTA检测外泌体粒子浓度为5.7×1011particles/mL总颗粒数2.85×1014particles平均粒径为135nm

图5 | 外泌体粒径范围

② 免疫印迹(WB)检测3D外泌体表面标志物表达:

外泌体阳性表面标志物:TSG101、CD63有清晰条带,外泌体阴性表面标志物Calnexin无表达。

图6 | WB鉴定结果

③ 透射电镜(TEM)观察3D外泌体结构:

TEM显示外泌体呈经典的“杯盘状”结构。

图7 | 外泌体结构

 

【外泌体应用方向举例

1、治疗性外泌体作为药物

由于外泌体富含生物活性物质,其本身就有一定的治疗潜力,在医用再生领域被应用于不同的组织修复和再生中。临床研究上已涉及心血管系统、内分泌代谢系统等。除了以上几个领域,干细胞来源的外泌体被应用到了糖尿病、骨关节炎、子宫内膜损伤修复、癌症等多种疾病领域。

图8 | 外泌体的应用方向

首先,外泌体可以促进细胞的修复和再生。衰老的三大主要原因就是细胞损伤、细胞营养不良、细胞失活,因此如何促进细胞新生是抗衰的关键所在[4]。外泌体能够远距离靶向调控细胞的修复、生长与分化,有效抑制细胞老化。有效运转营养物质渗入细胞,参与细胞更新、调理皮肤、改善肤质,令肌肤恢复年轻、健康的状态。

采用不同培养方式(2D、3D)培养的间充质干细胞,收集其分泌的外泌体进行促细胞增殖实验。将基础培养基中加入不同浓度的外泌体进行细胞(MSC)培养4天后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。如图9,2D和3D来源的外泌体均有促进细胞增殖的功能,且促细胞增殖能力3D-exosomes优于2D-exosomes。

图9 | 2D、3D外泌体促进细胞增殖倍数

再次,外泌体可以促进成纤维细胞增殖。成纤维细胞是皮肤真皮层中的主细胞群,它们的健康和活性关乎着皮肤的健康和美丽。外泌体可以增强成纤维细胞的增殖能力,达到逆转成纤维细胞老化的作用。

同样,采用不同培养方式(2D、3D)培养的间充质干细胞,收集其分泌的外泌体进行促成纤维细胞增殖实验。将组1(图10)和组2(图11)中加入不同浓度的外泌体培养成纤维细胞,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。两组实验中,2D-exosomes和3D-exosomes对成纤维细胞均有增殖作用,且促成纤维细胞增殖能力3D-exosomes优于2D-exosomes。随着外泌体浓度的增加,促增殖能力减弱,外泌体浓度在25μg/mL时展现较好的促增殖效果。

图10 | 基础培养基+不同浓度外泌体促成纤维细胞增殖效果

图11 | 含有1%FBS培养基+不同浓度外泌体促成纤维细胞增殖效果

2、外泌体作为哈药载体

外泌体作为一种“天然驯化”的内源性纳米载体,可以携带RNA,DNA,蛋白质等信号分子,能够在活体中维持其内含物的生物学活性,且具有免疫源性低,安全性高的特点,因此可以作为治疗性生物大分子的给药载体。例如外泌体可以作为治疗性核酸药物的给药载体,将mRNA、miRNA等传递到靶细胞,从而调控目的基因的表达,来起到治疗作用。

采用不同培养方式(2D、3D)培养的工程化细胞,接种相同细胞数(2D细胞接种密度1×106个/mL,10mL培养基;3D细胞接种密度5×105个/mL,20mL培养基),3D培养收集不同时间的细胞培养上清,收获的工程化细胞分泌的外泌体粒子总数3D-exosomes均比2D-exosomes数量多,且随着3D培养时间的增加外泌体分泌量也增加。图12为2D/3D不同培养方式、不同培养时间分泌的外泌体粒子总数。

图12 | 外泌体粒子总数

外泌体无论是作为治疗性药物还是作为给药载体,3D培养方式收获的外泌体相较于2D培养方式收获的外泌体在”质量”和”数量“上均展现出了更高的水平。华龛提供的3D培养方式也为外泌体相关科研领域的专家提供了更广阔的研究空间,期待与更多外泌体相关领域研究的爱好者合作,探索3D外泌体的新世界。

 

【技术服务

面对细胞培养和收集时的不同导向&节点,华龛也能提供相应技术服务。

1、服务项目

✦ 细胞上清生产服务:大批量生产干细胞、工程化细胞培养上清;

✦ 外泌体纯化服务:细胞上清中的外泌体纯化;

✦ 质量检测服务:细胞上清中微生物、内毒素、支原体、蛋白浓度、细胞分泌因子等检测。外泌体粒子浓度、粒径大小、透射电镜及免疫印迹等外泌体鉴定。

2、服务内容

✦ 提供定制化实验方案;

✦ 定制化三维细胞培养及细胞衍生物收集;

✦ 三维细胞培养工艺优化。

 

【参考文献

[1] Breakefield X.O., Frederickson R.M., Simpson R.J. Gesicles: Microvesicle “cookies” for transient information transfer between cells. Mol. Ther. 2011;9:1574–1576.

[2] Yu B, Zhang X, Li X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. Int J Mol Sci. 2014 Mar 7;15(3):4142-57.

[3] Ha D, Yang N, Nadithe V. Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes: current perspectives and future challenges. Acta Pharm Sin B. 2016 Jul;6(4):287-96.

[4] Ha DH, Kim HK, Lee J, Kwon HH, Park GH, Yang SH, Jung JY, Choi H, Lee JH, Sung S, Yi YW, Cho BS. Mesenchymal Stem/Stromal Cell-Derived Exosomes for Immunomodulatory Therapeutics and Skin Regeneration. Cells. 2020 May 7;9(5):1157. 



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