外泌体（Exosome, EXO）是一类直径30-150nm的微小囊泡，能够在活体中维持其内含物的生物学活性，且具有免疫源性低，安全性高、能跨越血脑屏障(BBB)等生物屏障等特点，是参与细胞间物质与信息传递的重要一环。因此在药物递送工具，疾病的新型诊断标志物或是治疗制剂领域，外泌体的基础研究和临床应用都呈现指数上升。

【外泌体的临床应用仍面临以下问题】

异质性：

人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别，细胞经体外培养扩增，每次外泌体的分泌数量和类型是不同的，这可能导致不同批次间产品的异质性；

细胞制备工艺的影响：

细胞培养方式（二维培养、三维培养），细胞培养条件（细胞类型、细胞传代、细胞密度、培养时间、培养基、外泌体收获频率）等都会显著影响外泌体产品质量（产量、外泌体组成和外泌体的生物活性等）。生产条件的微小变化可能会对外泌体产品质量和活性产生相当大的影响；

外泌体分离纯化方法选择和优化：

目前针对外泌体的分离纯化方法还没有统一的方案，现在使用的差速超速离心法、密度梯度离心法、免疫亲和法、聚合物沉淀法、超滤法等分离方法在操作性、处理量、纯度及成本等方面各有优缺点。由于外泌体粒径较小且与多种其他生物分子混合在一起，导致其分离纯化困难，因此，高效生产且可扩展的应用于大样本量外泌体的分离纯化技术，是外泌体临床应用所急需解决的问题；

外泌体的量化方案和质量标准：

目前对于分离获得的外泌体主要从三个层面进行鉴定：

① 通过Western Blot（WB）来鉴定外泌体表面标志物：CD9、CD63、CD81，内部标志物：TSG101、ALIX等；

② 电镜分析外泌体的形态特征：茶托型或一侧凹陷的半球形；

③ 通过NTA等手段分析样品中细胞外囊泡的群体特征：粒子浓度、直径分布等；

由于现在外泌体还缺乏统一的检测方法和标准化的技术规范，基于外泌体异质性的特点，使得外泌体临床前研究结果的有效性、可重复性以及结果的通用性依然存疑。因此对于外泌体的质量评价不能仅局限于检测过程中，还应包括检测前，即细胞或组织样本的选择问题，同时需要开发一种在单颗粒水平，快速、高通量检测的方法来进行质量监控；

外泌体的储存条件和方法：

提取后的外泌体的完整性和生物活性可能受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响，外泌体被提取后一般悬浮于磷酸盐缓冲液，实验室中常规的外泌体存储条件一般是4℃、-20℃、-80℃；-20℃ 或更低温度是比较可取的外泌体长期存储条件。外泌体应根据其临床转化应用的方向、结合来源、剂型、给药方式等因素，进行系统的储存条件及方法的质量稳定性研究。

组织选择及活体生物学分布：

外泌体进入受体细胞后的转归、生物分布、药代动力学和靶向递送器官分布的特异性以及疾病的治疗机制尚未完全阐明。

不同来源、不同给药方式的外泌体，在体内显示不同组织倾向的归巢能力，这可能是与其膜表面受体和细胞外基质结合蛋白有关；由于外泌体是由体内细胞自然释放的，因此也可以改造体内细胞以在体内释放工程化外泌体，通过工程化改造外泌体表面蛋白或者化学结构可以使其在特定组织器官中更富集。

【基于以上挑战，华龛生物可提供如下服务】

1、外泌体规模化、标准化制备

间充质干细胞外泌体（MSC-Exos）基于其抑制炎症反应、激活抗凋亡和促存活途径等促进组织修复和再生的作用，成为临床转化应用的热点，但GMP级药用MSC-Exos的生产仍然是行业一大挑战。

MSC-Exos规模化应用开发关键在于两点：

① 依赖于MSCs培养方式的规模化，

② 依赖于外泌体分离纯化方法的提升。

与传统的2D平面培养的MSC相比，采用华龛3D TableTrix®微载片及3D FloTrix®系列生物反应器培养的MSC显示出更高的外泌体分泌量。

采用3D工艺在MSC-Exos的生产中具有以下优势：

①可实现连续培养工艺，通过持续的培养基灌流，避免代谢副产物在生物反应器中积累，不同时间点连续收获外泌体；

②可实时收获间充质干细胞，收获符合干细胞治疗产品质量标准的间充质干细胞的同时保证外泌体的质量；

③可实现单批次，同一时间收获规模化外泌体产品，保证外泌体质量的均一性；

④结合3D FloTrix®vivaEXO外泌体收获系统，可在数小时内，将10L细胞培养上清浓缩至500ml，高效收获外泌体产品。

外泌体生产纯化流程图

1、外泌体的分离鉴定

根据国际细胞外囊泡研究协会（ISEV）针对囊泡研究提出的2018最小试验要求（MISEV2018），以及国内《人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡》团体标准（中国研究型医院协会），人间充质干细胞外囊泡（EVs，含外泌体）鉴定包括以下内容：

① 形态：透射电镜下应呈现不聚团的具有清晰膜结构的茶托状或杯状结构，边缘清晰；

②粒径：应分布在小于 200nm 范围内，且在范围内存在粒径峰值；

③ 标志蛋白：小细胞外囊泡表面标志物 CD9、CD81、CD63 中的任意两个表达阳性；小细胞外囊泡内部标志物 TSG-101、Alix 中的任意一个表达阳性；

④ 纯度：小细胞外囊泡阴性标志物 GM130 或Calnexin 应为阴性；小细胞外囊泡数量与蛋白量比值不低于 1×108个颗粒/微克蛋白；

⑤ 免疫调节：人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡与健康人来源的外周血单个核细胞共孵育，能抑制其增殖，抑制 Th1 细胞功能；

⑥ 微生物：HIV、HBV、HCV、HTLV、HEBV、HCMV、TP、真菌、细菌、支原体均应为阴性。

【华龛生物提供以下服务内容：】

① 规模化培养细胞质量鉴定；

② 纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）检测外泌体粒子浓度及粒径范围；

③ 免疫印迹(WB)检测3D外泌体表面标志物表达；

④ 透射电镜（TEM）观察3D外泌体结构；

⑤ 细胞培养上清中微生物、内毒素、支原体、蛋白浓度、细胞分泌因子等检测；

迄今为止，治疗性外泌体临床应用还存在不一致的问题，包括外泌体生产的所有领域，如外泌体分离、量化和表征的方法。规模化外泌体生产中标准化、简化的制备过程是临床前和临床环境中外泌体治疗产品结果可重复性的关键。

参考：

1. 《人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡》团体标准（中国研究型医院协会）

 

 

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【关于华龛生物】

北京华龛生物科技有限公司由清华大学医学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。核心技术源于清华大学的科技成果转化。公司专注于打造原创3D细胞“智造”平台，提供基于3D微载体的细胞规模化定制化扩增工艺整体解决方案。

华龛生物核心产品3D TableTrix®微载片（微载体），是自主创新型、首款可用于细胞药物开发的药用辅料级微载体。已通过中检院等相关权威机构的检验报告，并获得2项国家药监局药用辅料资质（CDE审批登记号：F20210000003、F20200000496）。同时，产品获得美国FDA DMF药用辅料资质（DMF：35481）。

华龛生物的产品与服务，可广泛应用于基因与细胞治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发。同时，在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）领域也具有广泛应用前景。

公司拥有5000平米的研发与转化平台，其中包括4000平米的GMP生产平台，1000余平的以3D细胞智造及微组织再生医学治疗产品为核心的CDMO服务平台；新建1200L微载体生产线。相关技术已获得100余项专利成果，30余篇国际期刊报道。核心技术项目已获得多项国家级立项支持与应用。