以下文章来源于干细胞者说（公众号）
越来越多的细胞与基因治疗（CGT）产品问世，用以治疗各种疾病和恢复受损组织功能。细胞与基因治疗产品属于FDA生物制品评估和研究中心（CBER）监管。开始临床研究之前，企业需要提交并获批准新药申请（IND）。开始上市销售前，需要提交并获批准生物制剂许可证申请（BLA）。
今天，借着美国FDA生物制剂评估和研究中心（CBER）Brian J Kwee和 Kyung E Sung 的一篇综述文献[1]，我们回顾一下细胞治疗产品的制造策略现状，挑战和应对。第一篇先阐述了常见的细胞疗法，第二章来讲讲细胞产品的制造策略。
临床级细胞疗法的开发（一）：基本概况
全球共有21种干细胞产品已在全球获得批准。值得注意的是，获批产品主要是由造血干细胞或间充质干细胞组成。目前全球批准的造血干细胞产品有10种，间充质干细胞产品有10 种，还有一个角膜缘干细胞产品。
▉ 造血干细胞
脐血来源的造血干细胞（HSC），引起移植物抗宿主病的风险较低，但遗憾的是，数量较少，不便大规模使用。如果规模化临床，就需要进行规模化扩增脐血来源的造血干细胞。
一般，2D培养工艺的造血干细胞扩增，通常会造成干细胞的丢失、扩增有限和归巢能力降低。原因可能是缺乏体内造血干细胞生态位（HSC niche）的模拟微环境所致。
生物反应器，可增强造血干细胞的扩增。在生物支架中扩增造血干细胞，可提供具有不同粘附和机械相关的3D微环境，可保持细胞“干性”，并促进细胞增殖。与2D培养相比，3D培养更有利于维持造血干细胞群体的原始功能。在纤维蛋白多孔支架上，造血干细胞增殖程度最大。
▉ 间充质干细胞
在免疫调控和组织修复的临床试验中，需要大量的间充质干细胞。因为从组织里获取的间充质干细胞数量较小，而临床所需量大。国际共识是，间充质干细胞的静脉输注剂量，人类通常为1~2 X10*6个细胞/kg。不同剂量可以影响治疗效果，因为间充质干细胞分泌的旁分泌因子取决于细胞数量。
目前，间充质干细胞制备技术分为两大类，包括平板制造工艺和生物反应器制造工艺。利用自体来源的间充质干细胞进行个体化治疗，属于小规模生产，各自企业的标准和工艺也不尽相同。同种异体来源的间充质干细胞规模化制造工艺是利用生物反应器，模拟其在体内的生长发育环境，进行高效率增殖。同时，可以满足自动化、量产并能保证细胞的高活率和高质量的要求，这也是今后各种干细胞规模化生产的发展趋势。
生物反应器，已经被用于间充质干细胞的扩增。微载体（有SoloHill®，CultiSpher®-S，Cytodex®-1，国内自主研发品牌华龛生物3D TableTrix®），可使间充质干细胞在搅拌过程中获得更大的生长。简单的说，如果说生物反应器是一个海洋，那微载体就是一个个岛屿，而干细胞就是居住在这些岛屿上的居民。干细胞可以在微载体上的有效扩增和分化，依赖其调节细胞形状和形成组织的能力。由于微载体具有多样性，利用特定微载体的合理设计，可能为规模化细胞制备提供均一稳定的制剂来源。
搅拌悬浮式生物反应器简图（干细胞者说制图）
-02-
全球共有12种免疫细胞产品获得批准上市。免疫细胞，目前只有T淋巴细胞和DC细胞产品被批准上市。其中大多数T淋巴细胞产品是用于血液系统恶性肿瘤的CAR-T细胞疗法，而 DC细胞产品是用于治疗实体肿瘤的疫苗。
T淋巴细胞需要三种信号刺激扩增，包括：T细胞受体；共刺激信号；促生存细胞因子。
关于T淋巴细胞扩增，有两种方法，一是用DC细胞刺激，二是用抗CD3/CD28免疫磁珠刺激。DC细胞刺激法比较常见，但成本太贵。抗CD3/CD28免疫磁珠刺激法，则不能提供生理相关的刺激因素。因此，采用先进的细胞制造策略，则可能提供有效的方法来扩增T淋巴细胞。比如通过下面几种方法：（1）抗CD3/CD28涂层聚二甲基硅氧烷珠，比传统免疫磁珠更诱导T淋巴细胞的扩增，可提供不同的机械因素；（2）抗CD3/CD28修饰的透明质酸水凝胶，也促进T淋巴细胞扩增的作用，较软的水凝胶比较硬更可有效地扩增小鼠CD8+T淋巴细胞。（3）抗CD3/CD28修饰的聚己内酯支架，提供了独特的微结构，有效诱导原代人类T淋巴细胞不同种群扩张的环境。（4）涂有IL-2的介孔二氧化硅微棒和抗CD3/CD28修饰的流体脂质双分子层，增强了原代T淋巴细胞的扩增能力，比传统的IL-2的免疫磁珠大2~10倍。（5）抗原肽修饰支架，比单核细胞衍生的DC细胞更大程度地诱导稀有T淋巴细胞的抗原特异性扩增。减少支架上的抗CD3/CD28数量，既增加了T淋巴细胞的增殖，也降低了它们的耗竭标记物。生物反应器，可进行动态培养和自动扩增。与静态培养相比，通过搅拌式生物反应器培养搅拌速度越快，细胞扩增效率越高。例如，CliniMACS Prodigy 便是全自动生物反应器的一种设备，可进行CAR-T细胞的分离、病毒转导和细胞扩增等。Lonza公司的Cocoon，则是一种封闭式生物反应器系统，同样可用于CAR-T细胞的分离、病毒转导和扩增。在人体血液中，天然的NK细胞和DC细胞含量比较少，需要进行体外扩增才能满足临床治疗用量。NK细胞，尚可进行体外培养扩增。DC细胞，则还不能进行体外培养扩增，目前只能依赖从外周血直接分离。
在IL-4和GM-CSF存在的条件下，血液中的单核细胞可分化为未成熟DC细胞，随后经抗原和细胞因子（如TNF-a、PGE2和/或LPS）刺激，最终成为功能成熟的DC细胞。
生物反应器，可用于DC细胞的扩增。生物反应器与细胞培养袋联合使用，可通过单核细胞制备出功能成熟的DC细胞。使用细胞培养袋，可降低污染风险，易于DC细胞扩增。一般来说，制备的成熟DC细胞和天然DC细胞没有显著差异。
生物反应器，可用于提高NK细胞的扩增效果。有证据表明，在组织培养瓶、氟聚合物细胞培养袋和波浪式生物反应器三种体系中，经生物反应器培养的NK细胞，细胞纯度和功能性细胞毒性更高。
与2D培养相比，3D培养的NK细胞可产生更多的细胞因子、增殖效果更强，抗肿瘤功效更好。在多孔胶原海绵中，NK细胞的体外扩增也有类似的效果。
-03-
文末小结
细胞疗法是目前临床前和临床环境中研究最多的治疗方式之一，许多细胞治疗产品已获得批准。截止目前，全球经批准的细胞治疗产品共33款，包括12种免疫细胞和21种干细胞（含10种造血干细胞相关产品）。值得注意的是，许多已经批准的细胞疗法正在开发新的适应症。
用于临床级细胞扩增的生物反应器
用于临床级细胞扩增的生物反应器案例
(a)在搅拌罐生物反应器中，动态培养原代T淋巴细胞，可增强T淋巴细胞的增殖。
(b)在波状生物反应器中，动态培养NK细胞，可提高NK细胞的细胞毒性和纯度。
(c)在带有粘附的BMSC的中空纤维生物反应器中，进行HSC培养，可增HSC的扩增效果。
(d)在搅拌罐生物反应器中的微载体上，培养MSCs，可使细胞生长更大。
如何提高细胞的制备效率？如何长时间维持细胞功能和特性？这是细胞临床治疗成功的关键。那么有没有可模拟人体生理微环境的仪器设备呢，微生理系统可以做到！下一期我们讲这一部分。
[1] BJ Kwee，KE Sung.Engineering microenvironments for manufacturing therapeutic cells Experimental Biology and Medicine 2021; 0: 1–12[2] Whatis Gene Therapy?, https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/what-gene-therapy(accessed 27 March 2021)[3] Theregulatory process from concept to market. In Lanza R, Langer R, Joesph V,Atala A (eds) Principles of tissue engineering. 5th ed. Cambridge, MA: AcademicPress, 2020,pp.1553–72[4] Celltherapies in the clinic. Bioeng Transl Med 2021[5] Approved Cellular and Gene Therapy Products, https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products(accessed 27 March 2021)[6] Biomanufacturingof therapeutic cells: state of the art,current challenges, and future perspectives. Annu RevChemBiomol Eng 2016;7:455–78[7] Golchin A, Farahany TZ. Biological products: cellular therapy and FDA approvedproducts. Stem Cell Rev Rep 2019;15:166–75[8] Valueand affordability of CAR T-cell therapy in the United States. Bone MarrowTransplant2020;55:1706–15
[9]Phinney DG. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implicationsfor cell therapy. J Cell Biochem 2012;113:2806–12
【华龛生物】
北京华龛生物科技有限公司由清华大学医学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。核心技术源于清华大学的科技成果转化。公司专注于打造原创3D细胞“智造”平台，提供基于3D微载体的细胞规模化定制化扩增工艺整体解决方案。
华龛生物核心产品3D TableTrix®微载体（片剂），是自主创新型、首款可用于细胞药物开发的药用辅料级微载体。已通过中检院等相关权威机构的检验报告，并获得2项国家药监局药用辅料资质（CDE审批登记号：F20210000003、F20200000496）。同时，产品获得美国FDA DMF药用辅料资质（DMF：35481）。
华龛生物的产品与服务，可广泛应用于基因与细胞治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发。同时，在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）领域也具有广泛应用前景。
公司拥有5000余平米的研发与转化平台，其中包括1000余平的以3D细胞智造及微组织再生医学治疗产品为核心的CDMO服务平台；还拥有4000平米的GMP生产平台，并新建1200L微载体生产线。相关技术已获得100余项专利成果，30余篇国际期刊报道。核心技术项目已获得多项国家级立项支持与应用。
[5] Approved Cellular and Gene Therapy Products, https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products(accessed 27 March 2021)[6] Biomanufacturingof therapeutic cells: state of the art,current challenges, and future perspectives. Annu RevChemBiomol Eng 2016;7:455–78[7] Golchin A, Farahany TZ. Biological products: cellular therapy and FDA approvedproducts. Stem Cell Rev Rep 2019;15:166–75[8] Valueand affordability of CAR T-cell therapy in the United States. Bone MarrowTransplant2020;55:1706–15[9]Phinney DG. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implicationsfor cell therapy. J Cell Biochem 2012;113:2806–12
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