【微载体】

微载体指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成，较传统二维平面基质可提供更大的细胞贴附面积，另外，利用微载体可以实现贴壁细胞的悬浮培养并借助生物反应器实现贴壁细胞的规模化生产，节省人力、物力和空间。

据GIR (Global Info Research)调研，按收入计，2021年全球微载体收入大约1062.9百万美元，预计2028年达到1321.3百万美元，2022至2028期间，年复合增长率CAGR为 3.2%。调研预测显示微载体的未来需求大规模扩增，但面对市场上琳琅满目的载体，我们如何进行选择呢？

下面我们将从几个方面进行简单介绍，帮助大家对微载体细胞培养有更多了解。

【载体结构与材质】

① 结构：

通常分为固体微载体（实心微载体和多孔微载体）和液体微载体。

图1：固体微载体的分类及优、劣势分析（点击查看大图）

② 材质：

微载体的制造材料也是细胞培养中的⼀个关键因素，因为它对细胞有物理和化学作⽤，包括孔隙率、机械强度、营养物质的渗透性、尺⼨、密度和形状^【2】。

▷ 人工合成的高分子材料：

例如聚苯乙烯微载体、中空玻璃微载体、聚苯烯酞胺微载体等；

▷ 天然来源的高分子材料：

例如交联明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、海藻酸、透明质酸等；

▷ 其他无机材料：

例如玻璃微载体等。

【贴壁依赖的动物细胞在微载体上贴壁、增殖和收获】

① 微载体影响细胞贴附的因素^【2】

（1）细胞与微载体的相融性

细胞与微载体的相容性主要与微载体基质表面的化学、物理性质相关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。

市场上常见的传统微载体采用的基本基质，如聚苯乙烯、葡聚糖、玻璃等聚合物为电中性的材质，无法支持细胞贴壁，因此通常修饰正电荷或化学键合，以促进具有不均匀表⾯负电荷分布的贴壁细胞的附着。⽽具有较⾼电荷密度的微载体被开发⽤于促进弱细胞系的细胞粘附（例如 Cytopore 1 和 2）。

▷ 微载体表面的化学修饰：

△ 将化学基团结合到载体表面是一种常见的方法（原理通过改变载体表面电荷的亲水性或疏水性）如氨基、伯胺、叔胺和三⼄胺等基团等改变载体表面电性或羧基化、羟基化提高微载体亲水性；

△ 引入含相关细胞贴附位点的蛋白，如：纤连蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白等。

（2）载体表面物理特征，包括形貌和粗糙度，如多孔或者实心。

（3）取决于细胞与微载体接触的几率

▷载体、细胞的接种密度；

▷ 搅拌条件：较低的搅拌速度利于细胞的接种，而MSC更适合减速接种^【2】

② 细胞在微载体表面的增殖的影响因素

影响细胞在微载体表面增殖或分化的因素很多，主要有三个方面。

（1）在细胞方面：如细胞群体、活性、状态和类型。

（2）在微载体方面：如微载体表面的生化性能、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢；表面物理特征如刚度和弹性模量、形貌等均会影响细胞的增殖或分化。文献报道刚性表面刚度在34Kpa时会导致MSCs呈纺锤状并向骨分化，表面为1Kpa的低刚度则促进了软骨、脂肪、神经元分化，而中等表面刚度则促进向肌肉分化^【2】。

（3）在培养环境中：如培养基组成、温度、pH、氧以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。

③ 贴壁依赖的动物细胞在微载体上的收获：

容易收获细胞或细胞制品是优秀微载体的一个关键指标，同时也是用户选择载体的关键指标之一。

目前市面上常规的传统微载体主要采用聚苯⼄烯、葡聚糖、纤维素或玻璃等不可温和降解的聚合物作为微载体的基本基质。因此在培养结束时，较难将细胞与微载体充分分离成为这些微载体在细胞收获过程中需要突破的挑战^【2】。尤其市面上常规的微载体通过表面修饰增强了电荷，依靠电荷提供较强的细胞贴壁效果，这使得在细胞分离时需要较强的酶消化强度和时间，而且不能保证细胞完全消化下来，如此导致较大的细胞损失和细胞损伤。

另一方面，不可降解的微载体与细胞均为固体物质，仅靠常规离心无法分离，需要额外的梯度离心或者过滤的方法将微载体去除以获得细胞，增加了整个生产过程的成本和过程的复杂性，降低了细胞回收率和活性。更进一步的，所收获的细胞用于治疗存在安全隐患，因为微载体颗粒若无法得到有效去除，其残留将导致后续细胞制品注射体内将引起血管堵塞或者异物排斥等安全性问题。

【应针对不同应用选择适合的微载体】

综上不难发现细胞能否在微载体表面附着生长并扩展取决于细胞的特性、微载体理化性质、培养基成分及培养条件。而微载体性能的优良与否是关键的因素，它不仅影响培养细胞的形态、贴壁率、生长速率、细胞密度以及是否容易收获细胞或其分泌产物，乃至于产物的整个生产成本。

针对不同的细胞类型不仅要筛选合适的微载体，也需要合适的接种条件及培养条件，而对于大多数细胞培养研发和生产的企业来说，对各类型微载体的认识不是很全面，在选择过程中有很多关键的因素根本考虑不到。

目前华龛生物能够提供基于不同细胞在微载体上从接种、培养，到体系放大和收获等一整套解决方案。广泛应用于细胞治疗、病毒疫苗、基因工程和组织工程等领域。

【实例】

① 生物医药领域的微载体应用现状——细胞治疗领域

间充质⼲细胞的临床应⽤需要数⼗亿个细胞和⼆维平台，这可能对扩⼤规模构成挑战。

为了在细胞移植和组织⼯程应⽤中获得可 扩展的未分化间充质⼲细胞数量，与⼆维培养相⽐，三维培养技术是⼀种更可靠的⽅法^【2】。

例如：华龛生物利用原创3D TableTrix^®W系列多孔可降解微载体、仅针对载体的裂解液结合自动化生物反应器和细胞收获装置可实现一次1010级别的间充质干细胞制剂产量。

图2：自动化封闭式工业级干细胞生产示意图^【4】

② 生物医药领域的微载体的应用现状——病毒疫苗领域(vero细胞)^【3】

文中提出已经工业化的微载体技术为使用 Vero 细胞系生产病毒提供了一个强大的平台，但实现更高的病毒生产力，该平台面临着一些挑战。与生物工艺相比与其他动物细胞系相比，Vero 细胞密度仍然相对较低，一般不超过 10⁷ 个细胞/mL（图3）。

                 图3：Vero细胞增值曲线

 文中给出的解决方案：

（1）更深入的研究：分析高细胞浓度下 Vero 细胞的状态（代谢组学、转录组学和蛋白质组织学等方面充分的研究）。

（2）更合适得培养策略：实时的营分和待测物浓度检测，并且及时的供给及排出^【3】。

实际上，目前华龛已经实现使用3D TableTrix^®V系列可高温灭菌微载体，配合3D FloTrix^®vivaSPIN 自动化生物反应器，在微载体4g/L~10g/L的条件下，连续培养一周的时间即可获得1×10⁷cells/mL的较高细胞培养密度。Vero细胞在微载体上，有较好的贴附能力，该细胞密度满足于疫苗的大量生产并且已有相关研究数据显示其产毒效率亦显著高于传统微载体（图4）。

图4：使用不同类型微载体培养Vero细胞产生的某病毒滴度对比

参考文献

[1] Berry JM, Barnabé N, Coombs KM, Butler M. Production of reovirus type-1 and type-3 from Vero cells grown on solid and macroporous microcarriers. Biotechnol Bioeng. 1999 Jan 5;62(1):12-9. doi: 10.1002/(sici)1097-0290(19990105)62:1<12::aid-bit2>3.0.co;2-g. PMID: 10099508

[2] Chen AK, Reuveny S, Oh SK. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 2013 Nov 15;31(7):1032-46. doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.03.006. Epub 2013 Mar 24. PMID: 23531528.

[3] Kiesslich S, Kamen AA. Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnol Adv. 2020 Nov 15;44:107608. doi: 10.1016/j.biotechadv.2020.107608. Epub 2020 Aug 5. PMID: 32768520; PMCID: PMC7405825.

[4] Zhang Y, Na T, Zhang K, Yang Y, Xu H, Wei L, Xu L, Yan X, Liu W, Liu G, Wang B, Meng S, Du Y. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. J Tissue Eng Regen Med. 2022 Aug 5. doi: 10.1002/term.3341. Epub ahead of print. PMID: 35929499.